Diagnostyka molekularna mleka krowiego

Metoda badania

Podczas używania omawianej techniki w laboratorium w pierwszej kolejności należy doprowadzić do wyekstrahowania DNA bakteryjnego. Obecność tłuszczu i białka z mleka znacznie utrudniają tę czynność, dlatego do tego celu zwykle służą specjalne dedykowane zestawy. W następnej kolejności doprowadzamy do wymieszania pozyskanego materiału genetycznego bakterii z zestawem starterów, które są w zasadzie matrycami znanych sekwencji nukleotydowych gatunków bakterii, których chcemy stwierdzić obecność. Podczas reakcji PCR dochodzi do powielania pasujących sekwencji DNA. Kluczową informacją interpretacji wyników jest zrozumienie, że możemy wykrywać tylko te patogeny, do których przygotowane zostały odpowiednie startery.

Kolejną niezwykle ważną informacją jest to, aby zrozumieć, że dzięki wymienionej technice PCR kopiujemy sekwencje DNA zarówno żywych, jak i martwych bakterii. Zatem identyfikacja bakteryjnego DNA nie gwarantuje, że obecnie występuje aktywne zakażenie bakteryjne w gruczole mlekowym. Zatem stosowanie badań molekularnych do podejmowania decyzji dla pojedynczych zwierząt, a zwłaszcza weryfikacji skuteczności leczenia, nie jest jeszcze dobrze zdefiniowana. Czułość real-time PCR jest istotna, gdyż nawet w 43% przypadków braku wzrostu otrzymanych metodą mikrobiologiczną udaje się uzyskiwać wyniki dodatnie na obecność patogenów wymienia (3, 4). Oczywiście wspomniana wysoka czułość może stanowić problem, przez co możemy otrzymywać wyniki fałszywie dodatnie (3). Dlatego tak samo jak w klasycznej mikrobiologii aspetyczne pobieranie próbek ma ogromne znaczenie (4).

Mleko zbiornikowe

Zastosowanie tego typu badania ma duże znaczenie w wyszukiwaniu stad z drobnoustrojami zakaźnymi z mleka zbiornikowego. Przede wszystkich Str. agalactiae. Używając tej metody, jesteśmy w stanie otrzymać wyniki przy niskiej prewalencji nawet na poziomie kilku procent (2). W sytuacji otrzymania wyniku dodatniego w teście PCR kolejną czynnością jest przystąpienie do badania przesiewowego każdej krowy w laktacji przy użyciu obecnie dostępnych metod klasycznej mikrobiologii (klasyczne badanie przesiewowe).

W sytuacji przeleczenia sztuk zakażonych i zweryfikowania, czy doszło do wyleczenia bakteriologicznego, należy weryfikować stan wolny od Str. agalactiae z mleka zbiornikowego stada znów przy użyciu technik PCR. Podobnie ma się sytuacja w przypadku stada zakażonego S. aureus. Z tą różnicą, że nie podejmujemy intensywnego leczenia, tylko wprowadzamy znane czytelnikom rozwiązania profilaktyczne wraz z zastosowaniem immunomodulacji. Inaczej jest w przypadku M. bovis. Po otrzymaniu wyniku dodatniego z mleka zbiorczego należy pobrać próbki od każdej sztuki w laktacji (mleko bańkowe) i tworząc pule (po 20 szt.) próbek dojść do informacji, które sztuki są zakażone. Dodatnie pule mleka krowiego rozpulowujemy na pule po 5 sztuk, aż do otrzymania wyników od sztuk pozytywnych na obecność M. bovis.

Interpretacja wyników patogenów środowiskowych z mleka zbiorczego nie jest już tak oczywista jak w przypadku patogenów zakaźnych. W tej sytuacji musimy korzystać z wartości Ct. Wspomniana wartość wskazuje nam, ile cykli powielania danego fragmentu DNA było potrzebnych, aby otrzymać pozytywny wynik. Im niższa wartość Ct, tym większa ilość danego fragmentu DNA bakteryjnego w danej próbce. Na ryc. 3 widać wyniki dodatnie dla wszystkich badanych patogenów.

Przyjmuje się, że wartości Ct < 37 świadczą o wyniku dodatnim (1). Interpretacja wyników takich patogenów jak:

• E. coli,
• Klebsiella spp.,
• Serratia spp.,
• Str. uberis,
• Str. dysgalactiae,
• Enterococcus spp.,
• Clostridium spp.,
• Bacillus spp.

powinna się opierać na ocenie zmian wartości Ct, gdyż patogeny te są obecne na każdej fermie i wynik dodatni nie jest niczym nadzwyczajnym. Jednak mogą się zdarzyć wyniki ujemne na obecność wymienionych patogenów, co będzie dobrą informacją dla badanej fermy.