Diagnostyka molekularna mleka krowiego

Zapalenie gruczołu mlekowego, jak powszechnie wiadomo, w głównej mierze jest spowodowane przez bakterie, które prowadzą do rozwoju stanu zapalnego, co obserwujemy w postaci wzrostu liczby komórek somatycznych (LKS), a także pojawienia się zewnętrznych objawów klinicznych (5). Ograniczanie liczby przypadków mastitis to nie tylko wdrażanie wiedzy na temat patogenów wywołujących mastitis. Niska LKS, niski odsetek zapaleń klinicznych to przede wszystkim sprawna odporność układu odpornościowego zwierzęcia. Na sprawny układ odpornościowy krowy wpływa mnóstwo czynników. Niemniej jednak bezpośrednią przyczyną zapaleń pozostają bakterie i nasze pierwsze działania powinny być ukierunkowane na zwalczanie patogenów mastitis.

W rozpoznawaniu patogenów mastitis króluje od szeregu lat klasyczna bakteriologia i ten fakt jeszcze długo się nie zmieni. Podstawową przyczyną tego stanu jest niski koszt badania. Badania z użyciem klasycznej bakteriologii będą jeszcze długo najtańszym rozwiązaniem. W klasyczną bakteriologię wplata się również nowatorska technika MALDI-TOF, ale nie zapominajmy, że jest ona tylko uzupełnieniem klasycznej bakteriologii i właściwie, aby nie podnosić dodatkowych kosztów badania, powinna być używana tylko w wątpliwych sytuacjach dla diagnosty laboratoryjnego. Doświadczenia własne wskazują, że dla prawidłowego rozpoznania patogennej bakterii w znacznej części wystarczy używać już dostępnych narzędzi. Owszem, sytuacje wątpliwe, czyli mniej niż 10% przypadków, winny być badane z użyciem technik MALDI-TOF.

Brak wzrostu drobnoustrojów

Nie bez zastanowienia pozostają wyniki braku wzrostu z mleka ćwiartkowego. Odsetek takich wyników sięga w gospodarstwach zwykle 25-40% przypadków (6). W tej części pozostają rzeczywiste przypadki braku wzrostu, ale również takie sytuacje, w których klasyczna mikrobiologia nie jest w stanie dać odpowiedzi. Są to przypadki obecności:

• Mycoplasma spp. (w tym M. bovis),
• infekcji beztlenowcami (np. Clostridium spp., Bacillus spp.),
• wszystkich przypadków zakażeń bakteriami tlenowymi, gdzie czułość metod klasycznych jest niewystarczająca (np. S. aureus, E. coli).

Całe szczęście dużymi krokami wkracza w badanie mleka technika real-time PCR. Jest to nowoczesna i dokładna metoda pozwalająca potwierdzić lub wykluczyć obecność patogenu w badanej próbce mleka nawet w sytuacjach, gdzie stopień rozcieńczenia jest bardzo duży. Czułość klasycznej bakteriologii jest zbyt mała, aby mogła ona posłużyć do badania mleka zbiornikowego. Technika molekularna umożliwia namnażanie DNA bakteryjnego oraz monitorowanie liczby produktów powstających podczas kolejnych cykli (ryc. 1). Taka informacja jest cenna w celu określenia intensywności i stopnia zmian zakażeń w badanym stadzie. Do prawidłowej oceny potrzebujemy kliku wyników, a nie pojedynczego wyniku, aby tak naprawdę oceniać dynamikę zmian. W Europie Zachodniej technika ta jest z powodzeniem wykorzystywana do diagnostyki zakażeń patogenami zakaźnymi, jak: Mycoplasma spp., a w tym Mycoplasma bovis, S. aureus, Str. agalactiae, Prototheca spp.

Diagnostyka molekularna mleka jest zalecanym narzędziem do diagnostyki przesiewowej stad bydła mlecznego na całym świecie. Jednakże, aby badanie było dobrze przeprowadzone, niezbędne są fachowy personel i specjalistyczne urządzenia. W związku z tym cena za wykonywanie tego rodzaju techniki jest wyższa niż w przypadku klasycznych metod.

Diagnostyka molekularna nie umożliwia nam de facto wyszukiwania konkretnych gatunków bakterii, tylko ich materiału genetycznego w mieszaninie DNA innych drobnoustrojów. Wszystko sprowadza się do tego, jakiego genu szukamy. Dla przykładu, gen koagulazy (np. coa) może być znajdowany nie tylko u gronkowca złocistego, ale również u innych gronkowców. Jednakże identyfikacja szczepów za pomocą testów genotypowych (PCR) jest dziś uważana za najbardziej powtarzalną i dyskryminującą uzyskany wynik, w porównaniu do metody fenotypowej, czyli klasycznej mikrobiologii (8). Nasuwa się kolejne pytanie, czy może nie należałoby jednak pozostać przy klasycznej mikrobiologii, pogłębiając jednak diagnostykę przy użyciu testów biochemicznych (np. API) czy MALDI TOF. Okazuje się, że nie są to lepsze rozwiązania w porównaniu do techniki PCR (7).