Hemofilia typu A i B u psów

Po zidentyfikowaniu w miejscowości Chapel Hill (Północna Karolina) przyczyny w postaci mutacji identyczną mutację wykryto w grupie psów z hemofilią różnych ras (pierwotnie dwa sznaucery miniaturowe z hemofilią, cztery suki nosiciele mieszańce sznaucera i epagneul breton oraz zdrowy beagle) na University of Queen w Kanadzie. U osobników z hemofilią obserwowano znaczące zmniejszenie aktywności czynnika VIII w osoczu oraz poziomu antygenu czynnika VIII poniżej 10%.

Badanie techniką southern blot wykazało obecność co najmniej pięciu kopii tej sekwencji w genomie psów, a jedna z tychże kopii znajdowała się w pobliżu miejsca donorowego eksonu 22, natomiast inna kopia – w obrębie intronu 22, i stąd autorzy zaproponowali istnienie wewnątrzchromosomalnego procesu rekombinacji, zachodzącego pomiędzy tymi dwoma kopiami, a prowadzącego prawdopodobnie do inwersji intronu 22 (Hough i wsp., 2002).

W genie czynnika VIII zidentyfikowano również dwie mutacje punktowe. Obecność mutacji nonsensownej (c98G>A) opisano u owczarka niemieckiego z ciężką hemofilią A (aktywność czynnika VIII <1%). Jako że ta wymiana nukleotydu przedwcześnie generuje kodon stop w procesie transkrypcji, autorzy wysunęli przypuszczenie, że krótki transkrypt kodowałby skrócone białko czynnika VIII, które ulegałoby szybkiemu rozkładowi (Mischke i wsp., 2011A).

Drugą mutację punktową (c.6217 T>C) wykryto u doga niemieckiego z ciężką postacią hemofilii A oraz aktywnością czynnika VIII na poziomie 4%. Obserwowana wymiana nukleotydu prowadzi do substytucji wysoce konserwatywnego tryptofanu przez argininę w domenie C1 białka, skutkując zmianą w jego strukturze (Alcaraz i wsp., 2013).

U psów w eksonie 14 genu czynnika VIII wykryto dwie insercje: pierwszą opisano u hawańczyków z hemofilią, u których aktywność czynnika VIII wynosiła 10% oraz 15%. Analiza sekwencji genu VIII u psów wykazała obecność krótkiego rozproszonego elementu jądrowego za nukleotydem 2675 cDNA czynnika VIII, który zawierał kilka kodonów stop. Autorzy wysunęli przypuszczenie, że skrócone białko czynnika VIII u pacjentów miało czynność resztkową spójną z fenotypem (Mischke i wsp., 2011B).

Niedawno opisano również inną insercję u mieszańca pudla z hemofilią (aktywność czynnika VIII na poziomie 5%), w którym to przypadku wykryta insercja zawierała krótką sekwencję 5 par zasad z następującym po niej ogonem polyA, a sekwencja ta była otoczona po obu stronach zduplikowanym DNA z 15 par zasad. Badanie tej insercji wykazało transkrypcyjne przesunięcie ramki odczytu oraz przedwczesne wygenerowanie kodonu stop na początku insercji, c.3217-3219, sugerując, że taka mutacja prawdopodobnie prowadzi do wytworzenia krótszego produktu translacji aminokwasów niż w typie dzikim (Alcaraz i wsp., 2013).

Mutacje odpowiedzialne za występowanie hemofilii B wykryto oraz opisano u pięciu ras psów, jak również u mieszańców (tab. 1, s. 16). Pierwszą z tych mutacji, c.1477G>A, rozpoznano u mieszańca z ciężką postacią hemofilii B (przy braku wykrywalnego w osoczu czynnika IX), pochodzącego z grupy psów z miejscowości Chapel Hill (krzyżówka cairn terriera i beagle’a). Wykryta mutacja punktowa prowadzi do substytucji kwasu glutaminowego przez glicynę, co skutkuje powstaniem kilku strukturalnych konfliktów oraz zakłócenia o charakterze hydrofobowym w obrębie wewnętrznego regionu czynnika IX. Uzyskane wyniki pozwoliły autorom potwierdzić, że c.1477G>A jest mutacją powodującą hemofilię typu B u tych psów (Evans i wsp., 1989A).

Kolejną mutację niesynonimiczną, c.752G>A, zidentyfikowano u psów rasy rhodesian ridgeback z ciężką postacią hemofilii B oraz aktywnością czynnika IX <5%. Analiza sekwencji genu czynnika IX u osobników chorych i nosicieli wykazała zamianę nukleotydu z G na A w eksonie 7, prowadzącą do substytucji glicyny na kwas glutaminowy w katalitycznej domenie białka. Z uwagi na różnice w łańcuchu bocznym oraz w ładunku pomiędzy zmodyfikowanym aminokwasem a typem dzikim aminokwasu autorzy zasugerowali, że zmieniony aminokwas jest prawdopodobnie przyczyną modyfikacji w układzie przestrzennym miejsca aktywnego, o kształcie kieszonki, w domenie trypsyny (Mischke i wsp., 2011C).

Opisano również insercje będące mutacją przyczynową powodującą hemofilię typu B u psów. Pierwszą wykryto u airedale terrierów wykazujących typowe objawy ciężkiej postaci hemofilii B przy aktywności czynnika IX <1%. Zidentyfikowano 5 kb insercję po nukleotydzie 1471 w eksonie 8. Ta insercja zakłócała przebieg procesu splicingu mRNA czynnika IX, co skutkowało powstawaniem skróconego dojrzałego mRNA, w którym brakowało więcej niż 150 par zasad w eksonie 8 i większości z regionu 3’UTR, a które kodowało nieprawidłową sekwencję zawierającą kodon stop.

Jako że domena katalityczna jest kodowana przez ekson 8, wskazano na możliwość przekształcenia miejsca wiązania czynnika X (Gu i wsp., 1999). Ponadto w pięciu pokoleniach wyżłów niemieckich szorstkowłosych wykryto rozległą mutację typu insercja w obrębie intronu 5. U psów stwierdzano hemofilię typu B łagodną po umiarkowanie ciężką, przy aktywności czynnika IX wynoszącej około 5%. Analiza sekwencji intronów wykazała obecność 1,5 kb insercji w intronie 5 genu czynnika IX, która zawierała 5’ skrócony element LINE 1 oraz długi ogon polyA na końcu 3’, oba otoczone powtórzoną sekwencją złożoną z 15 par zasad. Jako że intronowe insercje LINE 1 wiąże się z nieprawidłowym przebiegiem splicingu oraz obniżonym poziomem ekspresji genów, wysunięto przypuszczenie, że zidentyfikowana mutacja u psów jest mutacją przyczynową czynnika IX u wyżłów niemieckich szorstkowłosych (Brooks i wsp., 2003).

W odróżnieniu od hemofilii A u psów wykryto również kilka delecji w genie czynnika IX. Na University of Cornell zidentyfikowano u airedale terriera i labradora z hemofilią odpowiednio częściową oraz całkowitą delecję w eksonie 8 genu czynnika IX. Psy cierpiały na ciężką postać hemofilii B (niewykrywalny antygen czynnika IX oraz aktywność czynnika IX poniżej 1%) (Sugahara i wsp., 1996). Ponadto u labradora wykryto drugą mutację delecyjną. U tego osobnika aktywność czynnika IX wynosiła 1%. W tym przypadku analiza genetyczna genu czynnika IX wykazała całkowitą delecję genu czynnika IX. To odkrycie sugeruje istnienie kilku sporadycznych mutacji u labradorów, będących przyczyną tej samej choroby (Brooks i wsp., 1997).

Częściową delecję genu opisano u mieszańców pit bull terriera z ciężką postacią hemofilii B (aktywność czynnika IX < 1%). Sekwencjonowanie eksonów oraz intronów genu IX wykazało częściową delecję genu od eksonu 1 do eksonu 6, prowadzącą do całkowitego braku mRNA czynnika X (Gu i wsp., 1999). U psów rasy lhasa apso z hemofilią zidentyfikowano delecję pięciu par zasad w nukleotydach 772-776 w połączeniu z zamianą C na T w nukleotydzie 777. W opisanym przypadku zwierzęta cierpiały na ciężką postać hemofilii B (poziom antygenu czynnika IX w osoczu poniżej 1%). Taka mutacja prowadzi do zmiany ramki odczytu podczas translacji oraz do przedwczesnego wygenerowania kodonu stop w reszcie aminokwasowej 146. Autorzy wyciągnęli wniosek, że w skróconym białku brakuje całego peptydu aktywującego oraz domeny katalitycznej i stąd nie powinno ono wykazywać żadnej aktywności enzymatycznej (Mauser i wsp., 1996).