Nowe badanie naukowców UPWr na temat komórek macierzystych zwierząt

Komórki macierzyste zwierząt to wyjątkowo cenny materiał. Naukowcy sprawdzili, że pobrane z pępowiny kotów mają różne właściwości. Można je wykorzystać w medycynie regeneracyjnej i do wspomagania rozrodu. Budzą nadzieje, ale i dylematy – gdzie są granice ingerencji genetycznej u zwierząt?

Komórki macierzyste od dawna zadziwiają zdolnością do tworzenia dowolnych innych komórek. Wciąż odkrywamy ich nowe właściwości i próbujemy je praktycznie wykorzystać – mówi prof. Wojciech Niżański, kierownik Katedry Rozrodu z Kliniką Zwierząt Gospodarskich Wydziału Medycyny Weterynaryjnej UPWr. Pismo „Theriogenology” o najwyższej reputacji naukowej opublikowało wyniki nowatorskich badań, które prowadził z międzynarodowym zespołem. Uczestniczyła w nim Meriem Baouche, biolożka, która przyjechała na doktorat z Algierii. – Zależało nam na połączeniu kompetencji biologa z naszymi weterynaryjnymi oraz polskiej uczelni z zagranicznymi – mówi współautorka badania dr hab. Małgorzata Ochota z Katedry Rozrodu. W wieloośrodkową pracę były zaangażowane międzynarodowe sławy: prof. Pascal Mermillod z INRA w Tours i dr Yann Locatelli z francuskiego Muzeum Historii Naturalnej, współpromotor pracy Meriem Baouche. W projekcie uczestniczyły także prof. Aleksandra Klimczak, kierownik Samodzielnego Laboratorium Biologii Komórek Macierzystych i Nowotworowych w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu oraz dr Agnieszka Krawczenko i dr Maria Paprocka.

Arystokratki na stole położników

Młode kocie arystokratki – rosyjskie niebieskie, brytyjskie, norweskie, persy, szkockie zwisłouche, maine coon, devon rex, ragdoll oraz dachowce – były ciężarnymi pacjentkami kliniki weterynaryjnej Uniwersytetu Przyrodniczego. W latach 2020-2021 podczas porodów, naturalnych i przez cesarskie cięcie, u 20 kotek pobrano całe sznury pępowinowe.

Badanie nie wymagało specjalnej ingerencji, bo pracowaliśmy jako położnicy i niejako przy okazji pobraliśmy potrzebny materiał. Pępowina jest traktowana jako odpad kliniczny, więc w tym przypadku nie było dylematów etycznych, jakie czasem towarzyszą badaniom na zwierzętach – mówi dr hab. Małgorzata Ochota. – Podczas porodów, podobnie jak podczas kastracji i sterylizacji rutynowo utylizuje się wartościowy materiał. Zamiast marnować te tkanki, staramy się wykorzystać je do badań przed utylizacją. Tym razem chcieliśmy ustalić, czy komórki macierzyste z różnych części pępowiny mają podobne cechy i czy są takie miejsca, z których możemy pozyskać więcej lub mniej tych komórek.

Komórki macierzyste pobrano z całej pępowiny, z naczyń pępowinowych oraz galarety Whartona. To tkanka łączna o żelowej konsystencji, którą w XVII wieku opisał angielski lekarz Thomas Wharton. Pełni funkcję odżywczą dla płodu ssaków, zawiera m.in. polisacharydy i jest dobrym źródłem komórek macierzystych. Wyizolowane z niej komórki hodowano na odpowiednich pożywkach oraz zbadano pod m.in. kątem morfologii i pluripotencji, czyli zdolności do różnicowania się w typy innych komórek. To metoda stosowana także w medycynie człowieka do bankowania komórek macierzystych.

Najwięcej, najlepsze, najaktywniejsze

Okazało się, że najwartościowsze są mezenchymalne komórki macierzyste z galarety Whartona. Po pierwsze, przetrwało najwięcej właśnie tych komórek, co jest ważne, bo w hodowli zawsze część materiału ginie. Po drugie, wykazywały one najwyższą zdolność do proliferacji, czyli namnażania się i większy potencjał różnicowania niż komórki z naczyń i z całej pępowiny. – Ustaliliśmy, że komórki z galarety Whartona mają najlepszą użyteczność kliniczną. Choć te z innych fragmentów pępowiny są nieco gorsze, to wszystkie są cennym materiałem – zaznacza dr hab. Ochota.

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) to komórki pierwotnej tkanki łącznej, powstające w okresie płodowym. Potrafią się samoodnawiać i różnicować w inne komórki, np. kości i mięśni. Do tej pory zbadano u kotów komórki macierzyste m.in. z tkanki tłuszczowej, szpiku kostnego i płynu owodniowego. Linie komórkowe pochodzące z pępowiny zwykle wykazywały wyższe zdolności proliferacyjne w porównaniu z MSC z innych dorosłych tkanek.

– Przyszłe zastosowanie komórek mezenchymalnych budzi duże nadzieje. Naukowcy liczą, że uda się je „przeprogramowywać” do różnicowania się w określone linie komórkowe, które mogą być wykorzystane w zwierzęcej medycynie regeneracyjnej, do tworzenia nowych tkanek i narządów. Duże nadzieje wiąże się z możliwością wykorzystania ich także w onkologii, dermatologii, chirurgii, ortopedii, gdzie komórki macierzyste posiadające specyficzną „plastyczność” rozwojową mogą być przydatne w stymulacji gojenia ran czy uszkodzeń pozabiegowych – mówi dr hab. Małgorzata Ochota.

– Kolejnym interesującym obszarem jest budowanie konstruktów tkankowych i organoidowych w oparciu o możliwość „przeprogramowania” komórek macierzystych w określone tkanki i narządy. Jeśli to się uda, prowadzenie badań nie będzie wymagało wykorzystywania zwierząt doświadczalnych. W naszym projekcie przewidziano pozyskiwanie z komórek mezenchymalnych tzw. pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. To niezwykle drobne cząsteczki zawierające silnie skoncentrowane substancje stymulujące, niezbędne do funkcjonowania tkanek i narządów. Z ich pomocą chcemy pobudzać dojrzewanie komórek rozrodczych i zarodków w warunkach in vitro, w programach ratowania ginących gatunków zwierząt – opowiada prof. Niżański.

Masz to jak w banku

Badania opublikowane w „Theriogenology”  to element szerszego planu ratowania ginących gatunków, który prof. Niżański prowadzi wraz z zespołem od niemal 30 lat.

Naukowcy podają dane: każdego dnia z powodu działalności człowieka (m. in. zanieczyszczenie środowiska i ograniczenie powierzchni życiowej) znika z Ziemi jeden gatunek zwierząt i roślin. Między 1970 a 2016 rokiem populacja dzikich zwierząt lądowych zmniejszyła się o 68 proc. gatunków. W XXI wieku wyginęły bezpowrotnie m.in. nosorożec długonogi, delfin chiński, koziorożec pirenejski, a tylko w ubiegłym roku – m.in. wiosłonos chiński, dzięcioł wielkodzioby, diugoń przybrzeżny. W 1998 roku w Czerwonej Księdze Ginących Gatunków znajdowało się tysiąc gatunków zwierząt, obecnie aż ponad trzy tysiące.

– Szukamy możliwości zakonserwowania materiału niezbędnego do rozrodu i podtrzymania istnienia bądź odtworzenia ginących gatunków. Tak, żeby zachować to, co jeszcze jest do ocalenia – mówi profesor. Jego praca nad technikami wspomaganego rozrodu zaczęła się w latach 90. od doktoratu o technikach kriokonserwacji nasienia psów. W 1995 roku udało się, dzięki sztucznej inseminacji rozmrożonym nasieniem, przeprowadzić pierwsze w Polsce ciąże i porody suk. Dwa lata później powstał Bank Nasienia Psów, w którego laboratoriach andrologicznych i endokrynologicznych pobiera się nasienie, mrozi w ciekłym azocie i wykorzystuje do sztucznej inseminacji. Opracowane procedury wykorzystuje się także u innych zwierząt, a pierwszy bank przekształcono kilka lat temu we Wrocławski Bank Nasienia Zwierząt Towarzyszących oraz Dzikich. Należy on do europejskiej sieci banków nasienia EVSSAR-European Veterinary Society for Small Animal Reproduction, prestiżowej organizacji skupiającej naukowców i weterynarzy zajmujących się rozrodem zwierząt. W zależności od gatunku i sytuacji komórki pobiera się od zwierząt post mortem, czyli po śmierci naturalnej lub „przy okazji” podczas zabiegów weterynaryjnych, pobierania próbek, podawania iniekcji, sterylizacji i kastracji. Pobierane są zarówno plemniki, jak i komórki jajowe oraz fibroblasty, czyli komórki tkanki łącznej.

Bank składa się z trzech oddziałów: Banku Nasienia Psów, Banku Komórek Somatycznych i Gamet Kotowatych i pierwszego na świecie Banku Nasienia Żubra, powstałego we współpracy z Białowieskim Parkiem Narodowym i SGGW. Żubry są ze sobą blisko spokrewnione, co może obniżyć ich odporność i zwiększa ryzyko różnych chorób. Lekarze weterynarii wspólnie z genetykami ustalają, które oocyty i plemniki połączyć in vitro tak, aby zarodki były możliwie najmniej spokrewnione.

– W wieloośrodkowym zespole, wspólnie z prof. Wandą Olech i prof. Anną Duszewską z SGGW uzyskaliśmy mrożone zarodki żubra. Prowadzimy badania nad możliwością rozwoju tych embrionów u surogatki krowy. Żubr to dzikie zwierzę, nieprzyzwyczajone do procedur inseminacji czy przeszczepiania zarodków, chcemy więc oszczędzić stresu samicom żubra. Pracujemy zatem nad tym, żeby nosicielką żubra mogła być krowa, ale wymaga to zastosowania leków wykorzystywanych np. przy przeszczepie narządów, które obniżają reakcję immunologiczną na obce tkanki – opowiada prof. Niżański.

Powiodła się nam sztuczna inseminacja kotek, pierwsza w Europie Środkowej. W 2019 roku w ten sposób we Wrocławiu przyszło na świat pięć kociąt rasy ragdoll. – To był prawdziwy sukces, bo z powodu anatomii oraz bardzo specyficznego cyklu płciowego kotek ten zabieg nie jest łatwy – mówi prof. Niżański. Nie zdecydował się jeszcze na wdrożenie zapłodnienia in vitro i transferu zarodków u dzikich kotowatych.

– Czekam do momentu, gdy będę miał pewność, że ta metoda jest już należycie sprawdzona. Na razie doskonalimy techniki, prowadząc badania modelowe na komórkach zwierząt domowych. Mamy ich nadprodukcję, przeprowadzamy tysiące kastracji. Sterylizując czy kastrując domowe koty pozyskujemy komórki, które wykorzystujemy, żeby wciąż się uczyć i optymalizować metody biotechniczne dla ratowania gatunków ginących. Nauczyliśmy się już mrozić plemniki, teraz optymalizujemy mrożenie oocytów i zarodków, tak żeby pomóc dzikim zwierzętom – wylicza profesor.

Liczby przerażają: wszystkie 38 gatunków kotowatych żyjących na wolności jest zagrożonych wyginięciem, m.in. ryś euroazjatycki i żbik europejski w Polsce (zostało u nas po ok. 200 sztuk).

We wrocławskim banku w temperaturze minus 196 stopni są przechowywane komórki kota domowego oraz m.in. tygrysa, ocelota, lwa afrykańskiego, pantery śnieżnej, żbika, rysia euroazjatyckiego, lamparta chińskiego, geparda, karakala, serwala, kota arabskiego, kota argentyńskiego. Nawet po wielu latach mogą zostać wykorzystane do sztucznej inseminacji, zapłodnienia in vitro lub klonowania.

Zgodnie z etyką, a nie modą

– Mówiąc o rozrodzie i rasowych zwierzętach, dotykamy bardzo ważnego tematu, jakim jest etyka reprodukcji. W świecie żyjących na wolności dachowców obowiązuje selekcja naturalna: rozmnażają się tylko te, które są płodne i silne. Reprodukcją kotów rasowych steruje człowiek. O włączeniu zwierzęcia w program reprodukcyjny w istotnym stopniu decyduje wygląd zewnętrzny, a w mniejszym płodność – mówią prof. Niżański i dr hab. Ochota.

Moda, popyt decydują o tworzeniu nowych ras czy cech. Przykładem są munchkiny, koty o skróconych łapach. W Niemczech od roku jest zakazana hodowla sfinksów, kotów pozbawionych sierści i wibrysów, czyli włosów czuciowych, które pomagają orientować się w przestrzeni – to tak, jakby zabrać kotu jeden zmysł.

Od dawna kontrowersje budzą rasy brachycefaliczne, w przypadku kotów przede wszystkim persy, a u psów: mopsy, buldogi francuskie i angielskie, pekińczyki, shih tzu. Zwierzęta te uwodzą dużymi oczami i płaską twarzą przypominającą dziecięcą. Niestety z powodu spłaszczonych twarzoczaszek i zwężonych nozdrzy niektóre z nich mają problemy z oddychaniem, z regulacją temperatury ciała, są często niedotlenione i szybko się męczą.

– Rasy te są piękne, ale należy dbać o to, aby nie utrwalano występujących u niektórych osobników ekstremalnych cech morfologicznych, na przykład krańcowego skrócenia nosa. W tym wielka rola lekarza weterynarii, który w momencie decyzji o rozmnażaniu zwierzęcia powinien opiekunowi czy hodowcy zalecić reprodukcję tylko tych osobników, które nie wykazują cech wpływających negatywnie na pracę serca, oddech czy rozmnażanie. Holandia już ogranicza ich hodowlę i promocję. Trzeba uświadamiać ludzi, edukować w tym zakresie. Nie jestem przeciwny tym rasom, a Holandia zastosowała metodę drastyczną. Chodzi o to, żeby nie rozmnażać osobników krańcowo przerasowionych – zaznacza prof. Niżański, współautor książki „Problemy zdrowotne psów ras brachycefalicznych”.

Naukowcy chcieliby wprowadzić w Polsce system kwalifikacji do rozrodu dla psów ras brachycefalicznych opracowany przez angielski Związek Kynologiczny i Uniwersytet w Cambridge. Zanim hodowca podejmie decyzję o krzyżowaniu konkretnych osobników, może skorzystać ze specjalnie przygotowanych schematów ułatwiających ocenę ryzyka występowania ciężkich problemów oddechowych u potomstwa. Test jest oparty o ocenę szerokości nozdrzy psa oraz wyników prób wysiłkowych psów: testu spaceru 6 minut i spaceru 1 km.

Arka nadziei dla przyszłych pokoleń

– Stosowanie technik wspomaganego rozrodu w badaniach do ratowania gatunków zagrożonych wyginięciem to wręcz nasza powinność. Próba spłaty długu wobec natury, którą tak bezmyślnie zepsuliśmy – uważa profesor Niżański, szef Wiodącego zespołu Badawczego „Innowacyjna diagnostyka i terapia weterynaryjna” i przewodniczący Komitetu Nauk Weterynaryjnych i Biologii Rozrodu PAN. W 2019 roku w plebiscycie organizowanym przez miasto został uznany za jednego z 30 Kreatywnych Wrocławian. Uhonorowano go za pomysł Bio Arki, która ma pomóc w zachowaniu ginących gatunków. Składają się na nią banki, w których są przetrzymywane zamrożone zarodki i gamety ginących gatunków. Przyszłe pokolenia, nawet za setki lat, będą mogły wykorzystać je do rozmnożenia wymierających zwierząt.

Bio Arka to także coraz szerzej zakrojona współpraca międzynarodowa, m.in. z Uniwersytetem w Gandawie, Uniwersytetem Mediolańskim, Uniwersytetem Wiedeńskim, Krajową Szkołą Weterynaryjną Alfort w Paryżu.

Wrocławianie wraz z prof. Ann Van Soom z Ghent, prof. Christine Aurich i prof. Sabine Schaefer-Somi z Uniwersytetu Weterynaryjnego z Wiednia, prof. Alainem Fontbonem z Alfort i prof. Cecilią Luvoni z Mediolanu prowadzą wspólnie badania i wymieniają się wiedzą. Wnoszą do wspólnej puli to, co potrafią najlepiej: Gandawa doświadczenie w endokrynologii i zapłodnieniu in vitro, Mediolan w modelowaniu 3D, Wiedeń w andrologii, Alfort w pracy klinicznej.

Dzięki współpracy z ogrodami zoologicznymi w Krakowie, Łodzi, Poznaniu, Opolu, Wrocławiu, Gdańsku naukowcy pobierają komórki od padłych dzikich zwierząt. Udało się w ten sposób zgromadzić materiał od 18 gatunków kotowatych. Podpisywana jest także umowa z siecią EAZA Europejskich Ogrodów Zoologicznych. W ramach projektu Akademickiego Partnerstwa Międzynarodowego NAWA prof. Niżański prowadzi międzynarodowe konferencje dotyczące rozrodu i programu ratowania gatunków oraz tworzy europejską platformę ośrodków pracujących nad tym tematem. Planuje kolejną publikację wspólnie z Meriem Baouche, dotyczącą dodawania komórek macierzystych do hodowli oocytów i zarodków in vitro dla poprawy wyników.

– Aktualnie kręci mnie także temat odmładzania plemników i oocytów, który również może pomóc w ratowaniu zagrożonych gatunków. Możliwość powstrzymania starzenia nabiera ogromnej wagi w przypadku materiału, jakim dysponujemy, pobieranego w wielu przypadkach po śmierci. Chcemy włączyć się w nurt badań nad starzeniem i spróbować zatrzymać lub nawet odwrócić zmiany starzeniowe w komórkach rozrodczych, aby zwiększać populacje gatunków zagrożonych – opowiada prof. Niżański. – Czy się uda? W tej pracy fascynujące jest to, że każde nowe badanie jest jak loteria, zawiera w sobie element gry.

Źródło: Komórki do zadań specjalnych