Klonowanie koni metodą transferu jądra komórki somatycznej
Pozyskiwanie oocytów służących jako „cytoplast”
Oocyty, służące przy klonowaniu jako „cytoplast”, mogą być pobierane z jajników post mortem, np. z rzeźni, lub in vivo metodą ovum pick-up. Kluczową rolę odgrywa również stadium/faza komórki jajowej, która zostanie wykorzystana do SCNT, powinna ona znajdować się w metafazie drugiego podziału mejozy (ryc. 1). Pozyskiwane kompleksy oocytów z komórkami warstwy cumulus (COC, ang. cumulus-oocyte complex) (ryc. 2) mogą również być poddane kriokonserwacji standardowymi metodami, należy jednak mieć na uwadze, że oocyty te są po separacji od komórek warstwy cumulus (ang. denuded). Pochodzenie lub genetyka dawcy oocytów jest mniej istotne, ponieważ płytka metafazowa wraz z ciałkiem kierunkowym zostaje usunięta podczas tzw. enukleacji oocytu i pozostaje jedynie ooplazma z organellami. Rola mitochondrialnego DNA, znajdującego się w ooplazmie po enukleacji, zostanie omówiona w dalszej części artykułu. Enukleację oocytów wykonuje się za pomocą mikromanipulatora w odpowiednim medium, w którym znajdują się oocyty (ryc. 3). Jest to najbardziej pracochłonny krok w SCNT. Zaleca się suplementację medium, w którym znajduje się oocyt z inhibitorem mikrofilamentów (tj. cytochalazyny B), w celu rozluźnienia cytoplazmy, co ułatwia mechaniczne usunięcie poprzez aspirację 5-15-proc. cytoplazmy oocytu zawierającej matczyne (jądrowe) DNA. Ponadto zaleca się dodawanie barwnika Hoechst do medium, dzięki któremu będzie możliwa weryfikacja, czy jądrowy DNA został w całości zaaspirowany (ryc. 4). Istotne jest ograniczenie ekspozycji oocytu na promieniowanie ultrafioletowe, które jest wymagane, aby uwidocznić zabarwione jądrowe DNA oocytu, w celu uniknięcia nadmiernego uszkodzenia cytoplastu (6).
którzy są subskrybentami naszego portalu.
i ciesz się dostępem do bazy merytorycznej wiedzy!
POSTĘPOWANIA
w weterynarii
